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全能核酸酶 Benzonase

Q:贴壁细胞如何处理

A:贴壁细胞去除培养基,用PBS洗后,100μL RIPA裂解?#28023;?#25110;其他哺乳动物细胞裂解?#28023;?#20013;加入1~5μL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解?#28023;?#31163;心取上清?#32431;?#36827;行下游实验。


Q?#30418;?#28014;细胞如何处理

A?#30418;?#28014;细胞离心收集后,在离心管中加入100μL RIPA裂解?#28023;?#25110;其他哺乳动物细胞裂解?#28023;?#21152;1~5μL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解?#28023;?#31163;心取上清?#32431;?#36827;行下游实验。


Q:组织样品如何处理

A?#33322;?0~100mg动物或植物组织研磨充分后,加入100~200μL裂解?#28023;?#21516;时加入1~5μL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解?#28023;?#31163;心取上清?#32431;?#36827;行下游实验。


Q:大肠?#21496;?#25110;其他细菌如何处理

A:细菌离心收集后,用裂解液或者研磨破碎后,每100μL加入1~5μL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解?#28023;?#31163;心取上清?#32431;?#36827;行下游实验。


Q:如何稀释

A:正常建议稀释比例(终浓度)为1:1000~1:20000,其中时间、温?#21462;?#31232;释比例为影响反应的正面因素。


Q:是否用PBS稀释

A:是的


Q:能否减少用量

A:如希望减少用量,可?#20204;?#25552;高反应温度或延长时间


Q:反应辅助因子

A:反应液中必须补加2-5mM Mg2+


Q:反应缓冲液

A:常用生物缓冲?#28023;?#22914;TBS、MOPS(pH6-8)等


Q:反应抑制因子

A:在含有以下物质,Benzonase的活性会降低50%或以上:
                  >150mM 一价阳离子,    >100mM 磷酸盐
                  >100mM 硫酸铵,        >100mM 盐酸胍
                  >0.1%SDS,             >1%Triton X-100
                  >1%Tween 20


Q?#21512;?#37322;后每次用多少量,如何试梯度?#31185;鶚技?#22810;少?

A:看不同的实验要求,添加量可以按照1/100-1/10000之间。真核细胞需要量比原核细胞量高,因为真核细胞中核酸含量高真核细胞起始添加量可以按照1/1000的比例添加,原核细胞可以按照1/10000的比例添加;4℃消化DNA添加量比室温消化DNA添加比例高,因为室温下Benzonase酶活力更高。普通CoIP实验,蛋白质表达实验可以?#23454;?#31245;加,对DNA残留要求高的实验,可以按照1/100的比例添?#21360;?


Q:怎样灭活Benzonase核酸酶?如何去除?

A:采用EDTA螯合金属离子会可逆地抑制Benzonase核酸酶活性,极端条件会造成不可逆失活,例如:100mM NaOH,70℃处理30min?#21462;enzonase核酸酶可采用阴离子交换柱或气相色谱法从目的产物中分离出去,由于这种核酸内切酶及其稳定,建议在终产物要求排除核酸酶的应用中不要使用Benzonase核酸酶。


Q:储存条件

A:保存于-20℃。储存buffer:20mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 2mM MgCl2, 50% glycerin。


Q:PH

A?#33322;?#35758;反应体系pH值为6~8


Q:反应?#34892;?#19981;需要加Mg2+

A:反应中Mg2+的终浓?#20219;?~10mM


Q:benzonase纯度

A?#28023;?9%


Q:benzonase作用

A?#26680;?#23558;核酸完全消化成3-8个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。


Q:benzonase特点

A?#20309;?#34507;白酶、内毒素污染,没有标签,方便下游实验操作


Q:酶活单位定义

A?#33322;?#22312;30min内,ΔA260降低1.0(相当于完全消化37μg DNA)定义为一个酶活单位,即1EU。


Q:benzonase应用

A:1、蛋白提取时去除核酸污染:在重组蛋白纯化或哺乳动物细胞裂解物下?#25105;?#27714;粘度较低的情况下,可以利用Benzonase核酸酶降低样品粘度以利操作;
     2、有效减少存放的外周血单细胞(PBMC)的结块现象;
     3、有利于不可溶性蛋白复性前,高质量包涵体制备;
     4、有效去除带负电荷的核酸对双向SDS-PAGE蛋白样品的影响;
     5、在非常广泛的条件下(6M urea, 0.1 M Guanidine HCl,  0.4% Triton X100, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF), 降解所有?#38382;降模?#21452;链,单链,线状,环状)DNA和RNA;
     6、去除蛋白质产?#20998;?#30340;污染,符合FDA关于核酸污染去除的规程;
     7、本产品可?#26434;?#22810;种细胞细菌裂解液配合使用,去除粗提物中的核酸,降低溶液粘性,提高蛋白质产量。


Q:Benzonase核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物是否兼容?

A:Benzonase核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物兼容,但含有EDTA的蛋白酶活性抑制剂。当EDTA浓度>1mM?#20445;?#20250;抑制核酸酶活性,建议:如果必须加EDTA,按照2倍EDTA浓度补加Mg2+


Q:目的蛋白不溶,需要进行变性条件纯化。Benzonase核酸酶能在尿素环境降解核酸吗?

A:?#23548;?#19978;,Benzonase核酸酶在具有尿素(6M)的情况下会增加活性。在尿素浓?#20219;?M?#20445;?#27963;性会先增加,再随着时间的延长活性降低。尿素浓?#20219;?M?#20445;珺enzonase核酸酶会在15min后出?#30452;?#24615;并失活。但在酶失活前,多数的核酸已被降解。如果Benzonase核酸酶的原浓度?#32454;呤保?#20250;部分补偿7M尿素的影响。


Q:产品的稳定性如何,如果不小心在室温放置几天后,酶活性会受到怎样的影响?

A:室温2-3天,对活力影响不大


Q:用全能核酸酶处理表达蛋白的粗提裂解?#28023;?#26469;去除核酸污染,但Taq酶纯化过程中避免不了少量细菌DNA的残留

A:Taq酶纯化?#20445;?#38500;了用Benzonase消化,后期还需要离子交换树脂和分子筛或者透析方法去除DNA残留


Q:反应条件

A:Benzonase 核酸酶的活性需要1-2mM Mg2+.而在单价阳离子浓度>50%,磷酸浓度>20mM,硫酸铵浓度>25mM等情况下,Benzonase 的活性会降低50%


Q:Benzonase 核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物可以兼容吗

A:Benzonase 核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物是可以兼容,但是?#26434;?#21547;有EDTA配?#38477;?#34507;白酶抑制剂混合物要特别小心,EDTA浓度大于1mM时会抑制Benzonase 的活性。


Q:benzonase与超声的作?#20204;?#21035;

A:超声的确可以破碎细胞或者组织,但是和benzonase有不同之处!

   1.benzonase可以将DNA和RNA消化成3-8个碱基的单磷核苷酸,而超声只能打碎为大片段,所?#28304;?#29702;完样品很多还是?#33527;?#31264;,不易吸取上样;所以在COIP实验?#20445;?#21152;入benzonase可以降低背景。

   2.如果目的蛋白被核酸包裹,只能使用benzonase将核酸消化,才能将蛋白释放;

   3.超声就是在冰上操作,也会产热,易降解热敏感的蛋白;benzonase可以在低温下消化,不会降解目的蛋白。


Q:哪些实验可能用得到benzonase,在哪一步骤加benzonase

A:例如:his蛋白纯化,IP实验。细胞裂解时


Q:样本黏度高,不易过柱

A:细胞破碎后由于含有大量DNA和RNA,黏度很高,过柱不容易。解决的方法有两种:1是用核酸酶。2?#37096;梢杂酶?#21387;匀浆。都可?#28304;?#21040;降低黏度的作用。
差别在于:用核酸酶,DNA和RNA可以绛解成小片?#20301;?#21333;核苷酸;高压匀浆用机?#23548;?#20999;力将DNA和RNA处理成?#27927;?#30340;片断。
超声波处理在处理小量表达的时候问题不大,但做大量蛋白表达的时候有困?#36873;?br />    核酸酶的另外一个重要应用是:若你的目的蛋白是DNA结合蛋白,那么纯化的时候最好先用核酸酶处理。  

Q:我的目的蛋白不溶,需要进行变性条件纯化。Benzonase核酸酶能在尿素环境消化核酸吗?

A:?#23548;?#19978;Benzonase核酸酶在有尿素(浓度可达6M)的情况下会增加活性。在尿素浓?#20219;?M时活性先增加,随着时间延长活性又有降低。尿素为7M?#20445;珺enzonase核酸酶15分钟后出?#30452;?#24615;并失活。但是在酶失活前多数核酸已经降解了。如果Benzonase核酸酶的原浓度?#32454;?#26102;会部分补偿7M尿素的影响。


Q:?#24471;?#20070;中建议100ul添加1-5ul 全能核酸酶benzonase,而最下面的tips中又建议1:1000-20000稀释,那么上一句1-5ul是指稀释前的量还是稀释后?

A:?#24471;?#20070;上的三个例子都是从上游实验开始 就使用全能核酸酶 其核酸残留较多,所以需要用量较多
   如果从下游实验开始 其中核酸残留本身已经比较少 则需要的全能核酸酶的用量 按照1:1000--1:20000的比例添加?#32431;?-----这也是?#35805;?#24037;?#23548;?#30340;使用方法
   科研实验的话 建议按照?#24471;?#20070;上面的建议 进行操作 效果更佳


Q:我的样本大概是100mL菌?#28023;?#25512;荐买多少Benzonase核酸酶?

A?#30418;?#35201;根据重悬菌体所需裂解液的体积来确定需要酶的量。若普通蛋白纯化,则需要浓?#20219;?5U/mL;核蛋白则需要100U/mL;病毒表达蛋白纯化需要浓?#20219;?2.5U/mL;疫苗产品需要量为0.9~1.1U/mL。

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