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GST-Resin

Q:GST-Resin 应用于哪些实验

A:实验室级别小量纯化GST融合蛋白
   纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质,如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶等
   GST Pull-down实验


Q:GST融合蛋白的表达

A:离心收集250 ml表达目标蛋白的大肠?#21496;?#20923;融或超声破菌于10-15 ml破菌缓冲液中,离心取上清。


Q:破菌缓冲液配方

A:20-50 mM Tris-HCl,pH 7.5-8.5,含0.25 M NaCl



Q:洗脱缓冲液配方

A:破菌缓冲液中补?#26377;?#37197;制还原型谷胱甘肽(GSH)到终浓?#20219;? mM,10 mg GSH干粉可配制5 ml洗脱缓冲液



Q:其他常用缓冲液配方

A:其它常用缓冲液为PBS


Q:GST融合蛋白表达?#20445;?#26159;否加入EDTA、PMSF

A:这一步可以?#23454;?#21152;入EDTA、PMSF等蛋白酶抑制剂


Q:流速过慢,如何处理

A:流速过慢,可以使用硅胶管控制上样速?#21462;?


Q:上样前如何?#33014;?#26609;子

A:上样缓冲液冲洗10个柱体积即为?#33014;?#26609;子


Q:上样后直接洗脱

A:样品上样完成以后,使用破菌缓冲液洗柱10-20个柱体积,注意将纯化柱侧壁上的残留样品冲洗干净。


Q:如何洗脱

A:使用2-6ml洗脱缓冲?#33322;?#26679;品从GST-Resin纯化柱上洗脱


Q:样品量较多,如何洗脱

A:如果样品量较多,可以使用大体积纯化柱,洗脱液的体积?#23454;?#22686;加


Q:正常流速是什么样

A:正常流速大约2秒一滴到1秒一滴之间。


Q:纯化结束后,如何保存

A:纯化结束以后,使用大量纯水洗柱,封闭上下两端以后保存在4 ℃,避免让柱子干裂或者冻结。


Q:同一根柱子是否可以纯化不同蛋白

A:纯化不同的融合蛋白请使用不同的柱子,如果需要再次用于纯化其它蛋白,建议使用8M尿素或者6M盐酸胍处理树脂。


Q:洗脱后,如何处理样品

A:样品洗脱以后,需要及时使用蛋白超滤管浓缩以及切换缓冲?#28023;?#24182;选择?#23454;?#26465;件保存目标蛋白。


Q:实验是否可以在常温下进行

A:在未知GST融合蛋白稳定性的情况下,整个纯化过程需要在4℃完成


Q:是否可以加蛋白酶抑制剂

A:可以使用蛋白酶抑制剂防止?#21040;?


Q:如何改善结合

A:可以在缓冲液中补加非离子去垢剂等改善结合,具体使用浓度参考以下:1% Triton X-100,1% Tween-20,1% CTAB,10 mM DTT,0.03% SDS,0.1% NP-40。


Q:如果gst蛋白为包涵体,是否可以直接纯化

A:如果GST融合蛋白是包涵体?#38382;劍?#37027;么只有做了复性以后,才可以使用GST-resin纯化,通常的复性过程耗时、耗力,并不容易成功。
   1、降低表达温度(16-22℃),降低IPTG诱导浓度(10-100 μM),缩短诱导时间(2-5小?#20445;?br />    2、做包涵体复性,或者换一?#30452;?#36798;载体。


Q:如果是包涵体蛋白,怎么变性(用什么溶?#28023;?#21464;性后怎么办

A:变性蛋白不能直接过GST柱子,必须复性后才能过柱。变性用8M尿素或6M盐酸胍,变性后的复性步骤如下:
   1.  破菌离心收集包涵体沉淀。
   2. 包涵体沉淀用含1%的Triton-100,超声重悬。再离心收集沉淀。
   3. 选作,步骤2再重复一遍。
   4. 包涵体沉淀用6M (如果6M不溶,补加尿素到8M)重溶,短暂超声可以辅助包涵体溶解。
   5. 离心,去掉不溶的沉淀。
   6. 配置复性缓冲?#28023;?#21547;1-5mM DTT,10%甘油的PBS或者TBS。(不用还原型谷胱甘肽是因为它影响GST柱料)
   7. 复性缓冲液预冷到0-4℃,电磁搅拌旋转下,将6M尿素中的变性蛋白,慢慢滴加到复性缓冲液?#23567;?#25353;照1体积的变性蛋白质,20-100体积的复性缓冲液的体积比稀释。
   8. 继续搅拌1小时。
   9. 选作,4℃静置过夜。
   10. 选作,离心去除未变性的蛋白质。如果纯重力上样,推荐做此步,防止柱子堵塞不流。
   11. 复性蛋白质上GST柱纯化。


Q:如?#31283;?#38500;GST标签

A:可以使用在柱酶切的方法,得到去除GST的目标蛋白。我们推荐TEV protease和PPase,因为这两种酶的特异性较好,都是带有Tag的重组酶,方便除去。其中PPase是和PGEX-6p-1载体配套的酶,效果很不错。


Q:一个过程需要多长时间

A:根据样本量时间在半个小时到2小时之间


Q:GST如何重生

A:0.1M NaOH 洗10个柱体积,然后立即?#33014;?#21040;?#33014;?#32531;冲液中,20%乙醇保存。


Q:如何保存

A:20%乙醇保存柱料


Q:洗脱缓冲液中的GSH浓度是否有要求

A:洗脱缓冲液中的GSH浓度不要太高,否则会改变洗脱缓冲液的pH,通常使用4-10 mM,注意高浓度GSH具有较强酸性,可能让蛋白失活沉淀。


Q:如果洗脱缓冲液中的GSH浓度过高了,如何处理

A:洗脱的缓冲液中含有高浓度的GSH,可能影响后续的实验。请使用超滤管或者脱盐柱进行除去。


Q:融合蛋白不能结合GST-resin

A:增加目标蛋白和GST-resin结?#31995;?#26102;间,多次过柱。有时候需要调整上样缓冲液的pH, 6-9之间。
?#37096;?#20197;尝试加入非离子去垢剂。


Q:融合蛋白GST没有活性

A:调整破菌条件,超声产生的热量可能使GST蛋白变性。


Q:融合蛋白被蛋白酶?#21040;?/span>

A:在破菌缓冲液中加入蛋白酶抑制剂,缩短纯化时间,降低温?#21462;?


Q:融合蛋白不能从柱子上洗脱

A:把洗脱GSH浓度提高到15 mM, 同时调整洗脱缓冲液pH到8.0-9.0;加入0.1% TritonX-100;增加NaCl浓?#21462;?


Q:洗脱的目标蛋白有大量杂带,虽然GST蛋白本身的稳定性很好,但融合蛋白有可能在表达过程中就发生?#21040;?/span>

A:可以使用抗体检测具体在纯化的哪一步发生?#21040;狻?#36890;常在破菌缓冲液中加入蛋白酶抑制剂、缩短纯化时间、降?#22242;?#20859;温度会有帮助。


Q:有些宿主细胞的分子伴侣蛋白会与融合蛋白结合

A:上样前加入5 mM DTT,或者使用10 mM MgSO4 50 mM Tris,2 mM ATP先反应20分钟,让伴侣蛋白去结合。


Q:超声裂菌过度,目标蛋白被打断

A:注意超声仪的工作功?#23460;?#21450;超声时间,使用显微镜控制裂菌。


Q:GST-resin可能有非特异性吸附

A:在上样缓冲液中加入去垢剂,可以有多种选择:1% TritonX-100、1% Tween-20、0.03% SDS或者0.1% NP-40。


Q:GST-resin作用

A:纯化具有GSH结合活性的谷胱甘肽转移酶(GST)以及其融合蛋白


Q:结合力

A:胶粒平均直径60微米,比表面积大,结合大肠?#21496;?#37325;组GST蛋白的能力大于8 mg/ml


Q:适用实验

A:可以满足大多数实验室级别小量纯化GST融合蛋白以及GST Pull-down实验所需。


Q:产品优势

A:◆性质稳定:用Sepharose为载体,?#24067;叟剂?#39640;纯度的谷胱甘肽,高特异性吸附;
   ◆重复性好?#21644;?#26679;实验条件下,保障实验结果的可重复性;
   ◆结合能力强:胶粒平均直径60微米,比表面积大,结合大肠?#21496;?#37325;组GST蛋白的能力大于8 mg/ml,每根1ml的GST-resin亲和柱一次可以结合大约10 mg GST融合蛋白。可以满足大多数实验室级别小量纯化GST融合蛋白以及GST Pull-down实验所需;
   ◆使用简单方便;
   ◆ 快速、温和
   ◆ 尤其适合在大肠?#21496;?#26118;虫细胞和哺乳动物细胞中表达的GST标签蛋白。


Q:除适用于大肠?#21496;?#34920;达的gst蛋白,昆虫细胞、哺乳细胞是否均可用

A:只要蛋白质带gst标签就可用gst resine纯化


Q:重复性怎么样

A:重复性非常好,纯度也非常高

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